Gramfärgning är en snabb teknik och används för att se närvaron av bakterier i ett vävnadsprov och för att klassificera bakterierna som grampositiva eller gramnegativa, baserat på de kemiska och fysiska egenskaperna hos deras cellväggar. Gramfläck används nästan alltid som det första steget för att diagnostisera en bakteriell infektion.
Denna färgningsteknik är uppkallad efter den danska forskaren Hans Christian Gram (1853 - 1938), som utvecklade tekniken 1882 och publicerade den 1884 som en teknik för att skilja mellan två typer av bakterier med liknande kliniska symptom: Streptococcus pneumoniae (även känd som Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) och bakterierna Klebsiella pneumoniae.
Steg
Metod 1 av 3: Förbereda mikroskopglaset
Steg 1. Förbered dig för att arbeta i laboratoriet
Använd handskar och ett långt hårband för att förhindra bakteriell kontaminering av provet du testar. Rengör arbetsytan under en dragskåp eller i ett annat välventilerat område. Kontrollera Bunsen -brännaren och se till att mikroskopet fungerar korrekt innan du börjar.
Steg 2. Sterilisera mikroskopglasglaset
Om glasskivan är smutsig, tvätta den med tvålvatten för att ta bort olja och smuts. Rengör objektglasen med etanol, glasrengöringsmedel eller någon annan metod som används av ditt laboratorium.
Steg 3. Lägg provet på glasrutan
Du kan använda Gram -färgtekniken för att identifiera bakterier i ett medicinskt prov eller en bakteriekultur som växer i en petriskål. För bästa resultat, använd Gram -färgning på tunna streck av provet. Det är lämpligt att använda prover som är mindre än 24 timmar gamla, eftersom äldre bakterier kan ha skadat deras cellväggar och kanske inte reagerar på Gram -färgning.
- Om du använder ett vävnadsprov, tillsätt 1-2 droppar till en glasskiva. Sprid jämnt på objektglaset för att bilda ett tunt lager av provsprinkling genom att skjuta det med hjälp av kanten på det andra sterila glasglaset. Låt det torka innan du gör nästa steg.
- Om du tar bakterier från en petriskål, sterilisera inokulationsslingan i en Bunsen -brännare tills den lyser och låt den svalna. Använd öglan för att droppa sterilt vatten på objektglaset, sterilisera sedan och kyla igen innan du använder det för att samla ett litet prov av bakterier. Rör försiktigt efter det.
- Bakterierna som framställts i buljongen måste omröras igen med hjälp av en virvelblandare och sedan tas med ympslingan enligt ovan, utan tillsats av vatten.
- Om du har ett provprov (vanligtvis gjort med ett litet handtag med bomullstopp), rör och vrid försiktigt pinnen över objektglaset.
Steg 4. En lite hög temperatur kan göra ett bra utstryk
Värmen håller bakterierna ovanpå bilden, så att de inte löser sig lätt under färgningsprocessen. Knacka snabbt på bilden två till tre gånger över en Bunsen -brännare, eller värm den på en elektrisk glidvärmare. Överhett inte, provet kan skadas. Om du använder en Bunsen -brännare bör det vara en liten men blå låga istället för en stor orange flamma.
Alternativt kan ett utstryk också göras med metanol genom att tillsätta 1-2 droppar metanol till ett torrt utstryk, torka kvarvarande metanol på objektglaset genom att lämna det i det fria. Denna teknik minimerar cellskador och ger en ren bildbildsbakgrund
Steg 5. Placera bilden över färgfacket
Färgbrickor är gjorda av metall-, glas- eller grunda plastplattor med ett mjukt nät som foder toppen. Placera objektglasen ovanpå dessa nät så att vätskan du använder kan dräneras i brickan.
Om du inte har ett färgfack kan du placera ett objektglas på ett plastfack för att skriva ut isbitar
Metod 2 av 3: Gram Stain Process
Steg 1. Häll den kristallvioletta vätskan över utstrykningen
Använd en pipett för att spruta ett prov av bakterier med några droppar kristallviolett färgämne, även känt som gentianviolett. Lämna den i 30-60 sekunder. Kristallviolett (KV) separeras i vattenlösning i KV+ och klorid (Cl-) joner. Dessa joner penetrerar cellväggarna och cellmembranen hos både grampositiva och gramnegativa bakterier. KV+ -ionen interagerar med de negativt laddade komponenterna i bakteriecellerna, vilket ger cellerna en lila färg.
Många laboratorier använder "Hucker" kristallviolett, som innehåller ammoniumoxalat för att förhindra nederbörd
Steg 2. Skölj Crystal Violet försiktigt
Luta objektglaset och använd en tvättflaska för att spruta en liten ström destillerat eller kranvatten över objektglaset. Vatten ska rinna ner över ytan av utstrykningen och ska inte sprutas direkt på utstrykningen. Skölj inte för mycket. Det kan ta bort färgning i grampositiva bakterier.
Steg 3. Skölj utstrykningen med jod och skölj sedan
Använd en dropper för att skölja ut smeten med jod. Låt den stå på i minst 60 sekunder, skölj sedan försiktigt på samma sätt som ovan. Jod, i form av en negativt laddad jon, interagerar med KV+ för att bilda ett stort sammansatt komplex mellan kristallviolett och jod (CV-I-föreningskomplex) i cellens inre och yttre lager. Detta komplex av föreningar kommer att behålla den violetta färgen på kristallvioletten inuti cellen, på de färgade platserna.
Jod är ett frätande ämne. Undvik inandning, förtäring eller hudkontakt
Steg 4. Tillsätt färgblekmedel, skölj sedan av snabbt
En 1: 1 blandning av aceton och etanol används vanligtvis för detta viktiga steg, som måste noggrant tidsinställas. Placera objektglaset i en viss vinkel, tillsätt sedan färgblekmedel tills det inte syns mer lila i vattnet som används för sköljning. Detta tar vanligtvis mindre än 10 sekunder, eller ännu mindre tid om blekmedlet innehåller en hög koncentration av aceton. Avbryt detta steg omedelbart, annars kommer färgämnet också att läcka ut kristallviolett från de grampositiva och negativa cellerna, och färgningsprocessen måste upprepas. Skölj omedelbart bort allt överflödigt färgblekmedel med den tidigare tekniken.
- Ren aceton (95%+) kan användas som ersättning. Ju mer aceton du använder, desto snabbare fungerar blekmedlet så du måste ägna mer uppmärksamhet åt tidpunkten.
- Om du har problem med att hålla reda på tiden för det här steget, lägg till färgblekmedel droppvis.
Steg 5. Strö motfärgen över utstrykningen, skölj sedan
En motfläck, vanligtvis safranin eller fuchsin, används för att öka kontrasten mellan gramnegativa och grampositiva bakterier genom att färga avfärgade (avfärgade) bakterier, dvs gramnegativa bakterier, rosa eller röda. Lämna i minst 45 sekunder, skölj sedan.
Fuchsin fläckar intensivt många gramnegativa bakterier, såsom Haemophilus spp och Legionella spp. Denna metod är bra för nybörjare
Steg 6. Torka bilden
Du kan torka dem i det fria för att torka, eller torka dem med bibulärt papper som säljs för detta ändamål. Gramfärgningsprocessen är klar.
Metod 3 av 3: Kontrollera färgresultaten
Steg 1. Förbered ljusmikroskopet
Placera bilden under mikroskopet. Bakterier varierar mycket i storlek, så den totala förstoring som krävs varierar från 400x till 1000x. Ett objektiv med nedsänkningsolja rekommenderas för en skarpare bild. Släpp nedsänkningsoljan på objektglaset, undvik rörelse medan du droppar för att förhindra att det bildas bubblor. Flytta mikroskoplinshandtaget så att objektivet snäpper på plats och rör vid oljan.
Oljedämpning kan endast användas på specialdesignade linser, inte på "torra" linser
Steg 2. Försök att identifiera grampositiva och gramnegativa bakterier
Undersök bilden under ett ljusmikroskop. Grampositiva bakterier verkar lila i färg, eftersom kristallvioleten är fångad i den tjocka cellväggen. Gramnegativa bakterier kommer att vara rosa eller röda, eftersom kristallviolett sköljs ut genom de tunna cellväggarna, där det rosa motfärgämnet tränger in.
- Om provet är för tjockt kan resultatet bli falskt positivt. Färg ett nytt prov om det visar alla grampositiva bakterier, för att se till att resultatet är korrekt.
- Om du använder för mycket färgblekmedel kan resultatet bli falskt negativt. Färg ett nytt prov om det visar alla gramnegativa bakterier, för att se till att resultatet är korrekt.
Steg 3. Jämför resultaten du ser med referensbilden
Om du inte vet hur bakterier ser ut, studera samlingen av referensbilder, vanligtvis sorterade efter form och gramfläck. Du kan också se onlinedatabaser på [National Microbial Pathogen Database, Bacteria in Photos och många andra onlinesidor. För att underlätta identifiering nedan är exempel på bakterier som vanligtvis förekommer eller är viktiga för diagnos, klassificerade efter deras Gram -status och form.
Steg 4. Identifiera grampositiva bakterier baserat på deras form
Bakterier klassificeras vidare efter deras form under mikroskopet, oftast som kocker (sfäriska) eller stavar (cylindriska). Här är några exempel på grampositiva bakterier (lila i färg) beroende på deras form:
- Grampositiva kocker vanligtvis stafylokocker (som betyder gruppkocker) eller streptokocker (som betyder kedjekocker).
- 'Grampositiva stavar som Bacillus, Clostridium, Corynebacterium och Listeria. Stavbakterierna Actinomyces spp. har vanligtvis grenar eller trådar.
Steg 5. Identifiera gramnegativa bakterier
Gramnegativa bakterier (rosa i färgen) klassificeras ofta i tre grupper. Kocker är sfäriska i formen, stavarna är långa och tunna, medan kockstänger är emellan.
- Gramnegativa kocker Den vanligaste är Neisseria spp.
- Gramnegativa stavar t.ex. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas och många andra. Vibrio cholerae kan ses som en vanlig stam eller en böjd stam.
- Gramnegativa "coccoid" (eller "coccobacilli") stavbakterier t.ex. Bordetella, Brucella, Haemophilus och Pasteurella
Steg 6. Kontrollera noggrant om resultaten blandas
Vissa bakterier är svåra att färga exakt, på grund av deras cellväggars sprödhet eller vaxartade natur. Dessa bakterier kan visa en blandning av lila eller rosa i samma cell, eller mellan olika celler i samma utstrykning. Bakterieprov som är äldre än 24 timmar kan visa detta problem, men det finns också vissa bakteriearter som är svåra att färga vid någon provtagningsålder. Dessa bakterier kräver mer specialiserade tester för identifiering, såsom syrafast färgning, observation i bakteriekultur, TSI-odlingsmedier eller genetisk testning.
- Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium och Propionibacterium spp. alla är grampositiva bakterier, men är ofta inte tydligt färgade.
- Små, smala bakterier som Treponema, Chlamydia och Rickettsia spp. svårt att färga med Gram -metoden.
Steg 7. Kassera alla återstående förbrukningsartiklar och utrustning
Detta avfallshanteringsförfarande varierar mellan laboratorier och beror på vilket material som används. Normalt kastas vätskan i färgningsbrickan i flaskor märkta som farligt avfall. Blötlägg objektglasen i 10% blekmedelslösning och släng sedan i en skarp behållare.
Tips
- Kom ihåg att Gram -färgresultat bara blir bra om provet är bra. Det är viktigt att informera patienter så att de kan ge ett bra prov (t.ex. skillnaden mellan spottning mot djup hosta för att få ett sputumprov).
- Som färgblekmedel reagerar etanol långsammare än aceton.
- Följ normala laboratorieföreskrifter för att säkerställa säkerheten.
- Använd en kindpinne för att träna, eftersom den innehåller både grampositiva och gramnegativa bakterier. Om du bara ser en typ av bakterier kan du använda för lite eller för mycket blekmedel.
- Du kan använda träspännen för att säkra bilden.
Varning
- Aceton och etanol är brandfarliga ämnen. Acetonen tar bort oljan från dina händer, vilket gör det lättare för din hud att absorbera andra kemikalier. Använd handskar och använd dem försiktigt.
- Låt inte utstrykningen torka innan du sköljer bort Gram -fläcken eller motfläckar.
Vad du behöver
- Nätverksprov
- Glasskiva
- Pipett
- Liten brandkälla eller glidvärmare eller metanol
- Vatten
- Kristallviolett
- Jod
- Färgblekmedel, till exempel alkohol eller aceton
- Safranin
