Spektrofotometri är en experimentell teknik som används för att mäta koncentrationen av ett löst ämne i en särskild lösning genom att beräkna mängden ljus som absorberas av ämnet. Denna teknik är mycket användbar eftersom vissa föreningar också kommer att absorbera olika våglängder av ljus vid olika intensiteter. Genom att analysera ljuset som passerar genom en lösning kan du identifiera föreningarna lösta i lösningen och deras koncentrationer. Verktyget som används för att analysera lösningar med denna teknik i laboratoriet är en spektrofotometer.
Steg
Del 1 av 3: Förberedelse av provet
Steg 1. Slå på spektrofotometern
De flesta spektrofotometrar måste värmas upp innan de kan ge exakta mätningar. Så starta maskinen och låt den sitta i minst 15 minuter innan du mäter provet.
Använd den här tiden för att förbereda provet
Steg 2. Rengör kyvetten eller provröret
I skolans laboratorier kan det finnas engångs provrör som inte behöver rengöras först. Om du använder en vanlig kyvett eller ett provrör ska du dock rengöra apparaten noggrant före användning. Skölj alla kyvetter med avjoniserat vatten.
- Var försiktig med kyvetter eftersom de är ganska dyra.
- Vidrör inte kyvetten vid sidan där ljuset passerar (vanligtvis behållarens klara sida).
Steg 3. Häll tillräckligt med prov i kyvetten
Den maximala volymen för en del av kyvetten är 1 ml, medan den maximala volymen för provröret är 5 ml. Dina mätningar ska vara exakta så länge spektrofotometerns ljus fortfarande kan passera genom provet och inte en tom del av behållaren.
Om du använder en pipett för att infoga prover, använd ett nytt tips för varje prov. På så sätt kan korskontaminering undvikas
Steg 4. Förbered kontrollösningen
Dessa lösningar som också är kända som ämnen eller ämnen innehåller endast lösningsmedlet i lösningen som analyseras. Om du till exempel har ett saltprov upplöst i vatten är den tomma lösningen du behöver vatten. Om vattnet du använder är rött bör du också använda en röd tom lösning. Använd en liknande behållare för att hålla den tomma lösningen i samma volym som provet.
Steg 5. Torka utsidan av kyvetten
Innan du sätter in kyvetten i spektrofotometern måste du se till att den är ren för att undvika störningar i mätningarna på grund av dammpartiklar eller föroreningar. Använd en luddfri trasa för att ta bort eventuella vattendroppar eller damm som fastnar på kyvettens utsida.
Del 2 av 3: Experimentera
Steg 1. Bestäm och justera ljusets våglängd för att analysera provet
Använd en enda våglängd av ljus (monokromatisk stråle) för att öka mätningseffektiviteten. Välj den ljusfärg som kan absorberas av det kemiska innehåll som man tror är upplöst i testprovet. Ställ in våglängden enligt specifikationerna för den spektrofotometer du använder.
- I skollaboratorier kommer dessa våglängder vanligtvis att anges i de experimentella instruktionerna.
- Eftersom provet kommer att reflektera allt synligt ljus, är våglängden för det experimentella ljusets färg vanligtvis alltid annorlunda än provets färg.
- Ett objekt visar en viss färg eftersom det reflekterar en viss våglängd och absorberar alla andra färger. Gräs verkar grönt eftersom klorofyllet i det reflekterar grönt och absorberar andra färger.
Steg 2. Kalibrera spektrofotometern med en tom lösning
Placera den tomma lösningen i kyvetthållaren och stäng spektrofotometern. På den analoga spektrofotometerskärmen finns en nål som kommer att röra sig baserat på ljusdetekteringens intensitet. När den tomma lösningen har satts in ska nålen flyttas till höger. Anteckna detta värde om du behöver det senare. Låt den tomma lösningen förbli i spektrofotometern och skjut sedan nålen till noll med justeringsknappen.
- Digitala spektrofotometrar kan också kalibreras på samma sätt. Detta verktyg är dock utrustat med en digital skärm. Ställ in avläsningen av den tomma lösningen till 0 med kontrollratten.
- Även om den tomma lösningen avlägsnas från spektrofotometern är kalibreringen fortfarande giltig. Så när du mäter hela provet reduceras ämnets absorbans automatiskt.
Steg 3. Ta bort ämnet och testa spektrofotometerns kalibreringsresultat
Även efter att den tomma lösningen har tagits bort från spektrofotometern ska nålen eller numret på skärmen fortfarande vara 0. Sätt tillbaka den tomma lösningen i spektrofotometern och se till att avläsningen inte ändras. Om spektrofotometern är korrekt kalibrerad med en tom lösning ska resultatet på skärmen fortfarande vara 0.
- Om nålen eller siffran på skärmen inte läser 0, upprepa kalibreringsstegen med en tom lösning.
- Om problemet kvarstår, sök hjälp eller låt någon kontrollera spektrofotometern.
Steg 4. Mät provets absorbans
Ta bort den tomma lösningen och sätt in provet i spektrofotometern. Vänta cirka 10 sekunder tills händerna har stabiliserats eller siffrorna på den digitala displayen slutar ändras. Anteckna provets transmittans och/eller absorbans.
- Ju mer ljus som passerar desto mindre ljus absorberas. Vanligtvis måste du registrera absorbansvärdet för provet som generellt uttrycks som ett decimaltal, till exempel 0,43.
- Upprepa mätningen av varje prov minst tre gånger och beräkna sedan genomsnittet. På så sätt blir resultaten du får mer exakta.
Steg 5. Upprepa experimentet med olika våglängder av ljus
Ditt prov kan innehålla flera föreningar som har olika absorbanser beroende på ljusets våglängd. För att minska osäkerheten, upprepa provmätningar vid 25 nm våglängdsintervall över ljusspektrumet. På så sätt kan du upptäcka andra upplösta kemikalier i provet.
Del 3 av 3: Analysera absorptionsdata
Steg 1. Beräkna provets transmittans och absorbans
Transmittansen är hur mycket ljus som kan passera genom provet och nå spektrofotometern. Samtidigt är absorbans hur mycket ljus som absorberas av en av de lösta kemikalierna i provet. Det finns många moderna spektrofotometrar som ger effekt i form av transmittans och absorbans. Men om du får ett ljusintensitetsvärde kan du också beräkna dessa två värden själv.
- Transmittansen (T) kan bestämmas genom att dividera ljusintensiteten som passerar genom provlösningen med mängden ljus som passerar genom den tomma lösningen. Detta värde uttrycks vanligtvis som ett decimaltal eller en procentsats. T = I/I0, där jag är provintensiteten och jag0 är den tomma intensiteten.
- Absorbans (A) uttrycks som en negativ bas 10 logaritm (exponent) transmittans: A = -log10T. Om T = 0, 1, A = 1 (0, 1 är 10 till effekten -1). Det betyder att 10% av ljuset passerar, medan 90% absorberas. Samtidigt, om T = 0,01, A = 2 (0,01 är 10 till effekten -2). Det betyder att ljuset som passerar är 0,1%.
Steg 2. Grafera absorbansvärdet kontra våglängden
Uttryck absorbansvärdet som y-axeln och våglängden som x-axeln. Från prickarna för alla absorbansresultat i varje våglängd får du provets absorbansspektrum och identifierar föreningens innehåll och dess förhållande i provet.
Absorbansspektra har vanligtvis toppar vid vissa våglängder. Dessa toppvåglängder gör att du kan identifiera specifika föreningar
Steg 3. Jämför ditt absorbansspektrum med en graf över en känd förening
Varje förening har ett unikt absorbansspektrum och har alltid samma toppvåglängd i varje mätning. Genom att jämföra grafen du får med en graf över en viss känd förening kan du identifiera lösningens innehåll i provlösningen.
